Vào khoảng năm 1550, cha Gaspar da Santa Cruz, dòng Đa Minh, từ Malacca đã tới Cồn Cao (Hà Tiên ngày nay) để truyền giáo ở miền Nam Việt Nam.
Năm 1659, Toà Thánh thiết lập giáo phận Đàng Ngoài và Đàng Trong. Đàng Trong gồm các tỉnh miền Trung, miền Lục Tỉnh Nam Kỳ, Cao Miên và Nam Lào do Đức cha P. Lambert de La Motte cai quản. Năm 1844, Đàng Trong lại được chia thành Đông và Tây. Đông gồm các địa phận miền Trung và Cao Nguyên, còn Tây là phần còn lại, trong đó có Cần Thơ. Năm 1850, Giáo phận Tây Đàng Trong được cắt phâàn đất từ phía nam sông Hậu, cùng với cả nước Cambodia, lập thành giáo phận Nam Vang. Giáo phận Nam Vang gồm cả phần đất thuộc giáo phận Cần Thơ và Long Xuyên và một phần Vĩnh Long và Mỹ Tho hiện nay.
Miền Lục Tỉnh Nam Kỳ (trong đó có miền đất thuộc giáo phận Cần Thơ ngày nay) nằm trên địa bàn truyền giáo. Năm 1913, linh mục thừa sai J.B. Chabalier coi sóc giáo xứ Bãi Giá và Sóc Trăng. Khoảng năm 1935, cha Phanxicô Trương Bửu Diệp coi sóc giáo xứ Tắc Sậy (bị giết năm 1946). Vào cuối năm 1938, trên phần đất thuộc giáo phận Cần Thơ hiện nay có 21 giáo xứ, 66 giáo họ, 28.226 giáo dân do 25 linh mục Việt Nam và 5 linh mục Pháp phụ trách. Năm 1954, số linh mục và giáo dân thuộc giáo phận Nam Vang tăng lên vì có thêm những người di cư từ miền Bắc sống tập trung đông đảo tại vùng Cái Sắn (thuộc giáo phận Long Xuyên hiện nay).
Ngày 20-9-1955, với Sắc chỉ Quod Christus, Đức Thánh Cha Piô XII cắt phần đất của Việt Nam thuộc giáo phận Nam Vang gồm 10 tỉnh lúc đó: An Giang, Kiên Giang, Phong Dinh, Chương Thiện, Ba Xuyên, Châu Đốc, Bạc Liêu, Hà Tiên, Sa Đéc và An Xuyên để lập nên một giáo phận mới lấy tên gọi là giáo phận Cần Thơ, và đặt cha Phaolô Nguyễn Văn Bình làm giám mục, hiệu toà Agnusiensi. Khi thành lập, giáo phận Cần Thơ có 148.610 giáo dân, 110 linh mục, 300 nữ tu dòng Chúa Quan Phòng, 10 nữ tu dòng Con Đức Mẹ, 3 nữ tu tu hội Bác ái Vinh Sơn, 11 sư huynh dòng La San và 9 đại chủng sinh.
Về nhận giáo phận năm 1955, Đức cha Phaolô Nguyễn Văn Bình ở nhà xứ của nhà thờ chính toà Cần Thơ. Năm 1956, Đức cha Phaolô cất tạm một Tiểu chủng viện tại Sóc Trăng và thu nhận 138 chủng sinh. Đến năm 1957, Đức cha mua đất và xây dựng toà giám mục tại đường Nguyễn Trãi, Cần Thơ, đồng thời mua đất tại Cái Răng (làm Tiểu chủng viện) và tại Bình Thuỷ (hiện nay làm cơ sở của dòng Con Đức Mẹ). Ngoài việc khuyến khích các linh mục lập thêm các họ đạo mới, Đức cha Phaolô đã cổ vũ việc xây cất các trường trung học và quan tâm đến những phương tiện truyền thông xã hội.
Ngày 24-11-1960, Toà Thánh thiết lập Hàng Giáo phẩm Việt Nam, nâng giáo phận hiệu toà Cần Thơ lên hàng giáo phận chính toà, thuộc Tổng giáo phận Sài Gòn. Ngày 27-11-1960, Toà Thánh lấy bốn tỉnh lúc đó là An Giang, Kiên Giang, Châu Đốc và Hà Tiên để lập giáo phận Long Xuyên, một phần tỉnh An Giang (Cù Lao Tây và Hồng Ngự) nhập vào giáo phận Mỹ Tho, phần khác của tỉnh là Sa Đéc nhập vào giáo phận Vĩnh Long. Toà Thánh cử Đức cha Phaolô Nguyễn Văn Bình về làm tổng giám mục Sài Gòn, cử Đức cha Philipphê Nguyễn Kim Điền làm giám mục chính toà đầu tiên của giáo phận. Sau khi phân chia, giáo phận Cần Thơ chỉ còn diện tích hơn 13.000km2 với 67 linh mục và 56.200 giáo dân trên tổng số dân là 1.410.000 người. Năm 1961 Đức cha Philipphê Nguyễn Kim Điền cho di dời Tiểu chủng viện Á Thánh Quý về Cái Răng, thiết lập Nhà Tu sĩ Truyền giáo tại Cái Khế, nhà hưu dưỡng cho các linh mục tại Cần Thơ, dòng Mến Thánh Giá tại Sóc Trăng.
Đức cha Philipphê Nguyễn Kim Điền cai quản giáo phận Cần Thơ được gần 5 năm. Ngày 22-3-1965, ngài được Đức Thánh Cha Phaolô VI bổ nhiệm làm Tổng giám mục Tổng giáo phận Huế, cũng vào chính ngày này, Đức cha Giacôbê Nguyễn Ngọc Quang được chỉ định làm giám mục chính toà Cần Thơ. Lúc đó giáo phận có 71.929 giáo dân, 72 linh mục, 149 nữ tu dòng Chúa Quan Phòng, 10 nữ tu dòng Con Đức Mẹ, 7 nữ tu dòng Mến Thánh Giá, 5 nữ tu Bác Ái Vinh Sơn, 55 đại chủng sinh và 205 tiểu chủng sinh. Đức cha Giacôbê đã xây cất thêm nhà cho Tiểu chủng viện Cái Răng, tập viện dòng Mến Thánh Giá, nhiều trường học, các cơ sở bác ái, và khởi công xây cất nhà thờ chính toà.
Ngày 6-6-1975, ngài tấn phong giám mục phó là Đức cha Emmanuel Lê Phong Thuận. Sau khi Đức cha Giacôbê qua đời (20-7-1990), Đức cha phó Emmanuel lên làm giám mục chính toà cho đến nay.
Ngoài việc phát huy những thành quả của các vị tiền nhiệm, Đức cha Emmanuel đã khuyến khích mọi thành phần Dân Chúa và mọi giới (gia trưởng, hiền mẫu, giới trẻ, thiếu nhi) nỗ lực xây dựng họ đạo thành một cộng đoàn đức tin, phượng tự và bác ái, nhằm mục tiêu truyền giáo. Trên cơ sở đó, mỗi họ đạo, mỗi hạt và giáo phận đã tổ chức nhân sự để phụ trách các sinh hoạt nhằm mục tiêu nói trên. Về cơ sở vật chất, Đức cha Emmanuel đã cho tu sửa nhà thờ chính toà, xây dựng cơ sở và nhà nguyện dòng Con Đức Mẹ, dòng Mến Thánh Giá, xây sửa tòa giám mục, và đặc biệt quan tâm đến Đại chủng viện Thánh Quý trong việc khai mở (năm 1988), nuôi dưỡng và tu sửa trường sở (năm 1999-2000). Từ năm 1988, Đại chủng viện Thánh Quý tại Cái Răng là một trong 6 đại chủng viện trên cả nước, nơi đào tạo các linh mục cho 3 giáo phận Cần Thơ, Vĩnh Long và Long Xuyên, nằm trong địa bàn 10 tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long. Trong hơn 10 năm qua, Đại chủng viện Thánh Quý đã đào tạo cho 3 giáo phận được trên 100 linh mục.
Cha G.B. Phạm Minh Mẫn, Giám đốc Đại chủng viện Thánh Quý, được Toà Thánh bổ nhiệm làm giám mục phó giáo phận Mỹ Tho và ngày 11-8-1993, Đức cha Emmanuel Lê Phong Thuận đã tấn phong giám mục cho ngài. 5 năm sau, Đức cha G.B. lại được bổ nhiệm làm Tổng giám mục giáo phận Thành phố Hồ Chí Minh.
Ngày 18-2-2003, Đức cha Emma-nuel đã tấn phong giám mục phó giáo phận Cần Thơ là Đức cha Stêphanô Tri Bửu Thiên, được Đức Thánh Cha Gioan Phaolô II bổ nhiệm theo Tông sắc ký ngày 6-11-2002.
Giáo phận Cần Thơ hiện nay nằm trên địa bàn 4 tỉnh: Cần Thơ (trừ huyện Thốt Nốt thuộc giáo phận Long Xuyên), Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau, với khoảng 176.424 giáo dân, 170 linh mục, 695 tu sĩ đang phục vụ trên 128 họ đạo.