Giáo phận Mỹ Tho được thành lập năm 1960, nhưng có quá trình hình thành và phát triển từ 200 năm trước, vì Mỹ Tho nằm trên vùng truyền giáo thuộc Lục Tỉnh Nam Kỳ, phần đất do các cha dòng Phanxicô, rồi Hội Thừa sai Paris và Thánh Bộ cùng với linh mục, tu sĩ và giáo dân Mỹ Tho cùng nhau chung lòng góp sức xây dựng giáo phận.
Vùng đất tại giáo phận Mỹ Tho được các thừa sai dòng Tên, Hội Thừa sai Paris đến tận nơi rao giảng Lời Chúa, hay người công giáo từ miền Trung vào đây sinh sống? Câu trả lời còn ở phía trước. Chỉ biết chắc, từ khi cha F. José García (dòng Phanxicô) coi sóc vùng Chợ Quán năm 1723, ngài mở rộng vùng truyền giáo xuống các tỉnh miền Tây như: Cái Mơn, Cái Nhum, Cà Hom (Thủ Ngữ), Mi-tho (Mỹ Tho), La-nung, Lan-loc, Ke-be (Cái Bè), Ruot-ngua (Ruất Ngựa), Rac-la (Rạch Lá) Rach-mieu (Rạch Miếu); vùng này có 3 cha coi sóc.
Năm 1730-1749, cha Francisco de la Concepción và cha Manuél de Vallermo hoạt động ở vùng cửa sông Cửu Long, coi các họ đạo Cà Hon (Thủ Ngữ), từ trụ sở chính, các ngài mở rộng vùng truyền giáo lập nhiều họ lẻ. Theo cha A. Launay: năm 1747, từ Thủ Đức tới Hà Tiên các cha dòng Phanxicô coi sóc 5.500 giáo dân, trên tổng số 9.000 giáo dân do các cha Phanxicô coi sóc trên toàn giáo phận Đàng Trong. Năm 1790-1800, còn 3 cha dòng Phanxicô: Francisco de Paulo, Juan Colat và Juan Mottaner coi sóc các họ: Chợ Quán, Cao Miên, hạt Tam Lách (Mỹ Tho, 8.500 giáo dân). Đến năm 1813, các cha Phanxicô không còn hoạt động ở vùng này nữa.
Năm 1822, vùng Mỹ Tho thêm một số cha dòng Phanxicô ngành Capuxinô, phần lớn là người Ý, các thừa sai của Thánh Bộ hoạt động từ thời Đức cha Pigneau de Béhaine (Bá Đa Lộc). Thời vua Minh Mạng, Thiệu Trị, Tự Đức và Văn Thân bách hại, ngoài vụ tàn sát nhiều giáo dân tại Định Tường, Ba Giồng (Tân Hiệp), Hữu Đạo (Cai Lậy), Thủ Ngữ, vào năm 1861-1862, giáo dân vùng Mỹ Tho bớt thiệt hại hơn so với các giáo phận trong vùng. Tại đất Mỹ Tho đã thấm máu nhiều vị Thánh anh hùng, đặc biệt Thánh Phêrô Nguyễn Văn Lựu (linh mục) và Thánh Anrê Nguyễn Kim Thông (giáo dân).
Năm 1938, phần đất thuộc giáo phận Mỹ Tho ngày nay có 18 giáo xứ, 61 giáo họ, 20 linh mục Việt, 2 linh mục Pháp và 16.702 giáo dân.
Ngày 27-11-1960, Toà Thánh ban Sắc chỉ Quod Venerabilis Fratres thành lập giáo phận Mỹ Tho gồm 5 tỉnh: Định Tường, Long An, Hậu Nghĩa, Gò Công, Kiến Tường (Mộc Hoá) và 2/3 tỉnh Kiến Phong (Cao Lãnh). Đức cha Giuse Trần Văn Thiện làm giám mục tiên khởi. Khi thành lập, giáo phận Mỹ Tho có 39 giáo xứ, 32 nhà thờ, 54 nhà nguyện; 50.249 giáo dân, 43 linh mục, 28 đại chủng sinh học tại Giáo hoàng Học viện Piô X Đà Lạt và Đại chủng viện Sài Gòn, 77 tiểu chủng sinh học ở Cần Thơ và Sài Gòn. Khoảng 153 tu sĩ thuộc các dòng: Sư huynh La San, MTG Cái Nhum. Đến năm 1974, giáo phận Mỹ Tho có 186 giáo xứ và họ đạo, 71 linh mục, 78 đại chủng sinh và 63.158 giáo dân.
Sau ngày đất nước Việt Nam thống nhất (30-4-1975), các tỉnh được phân bổ lại, giáo phận Mỹ Tho hiện nay gồm các tỉnh: Tiền Giang, Long An và 2/3 tỉnh Đồng Tháp (gồm thị xã Cao Lãnh, các huyện Cao Lãnh, Thanh Bình, Tân Hồng, Hồng Ngự, Tam Nông và Tháp Mười).
Ngoài việc xây dựng những cơ sở vật chất như toà giám mục, Tiểu chủng viện Gioan XXIII và một số trường trung tiểu học như: Thánh Giuse, Rạng Đông, Thánh Gioanna, Đức cha Giuse Trần Văn Thiện rất quan tâm đến việc đào tạo con người qua các hoạt động Công giáo Tiến hành, bác ái. Ngài cũng cho phát hành tờ nguyệt san Đồng Tháp trong toàn giáo phận. Vào năm 1974, giáo phận Mỹ Tho có 63.158 giáo dân (chiến 3,8% dân số), 41 giáo xứ, 71 linh mục, 186 nữ tu, 88 trường trung tiểu học và 4 cơ sở từ thiện xã hội.
Để chuẩn bị cho người kế nhiệm, Đức cha Giuse đã tấn phong linh mục Anrê Nguyễn Văn Nam làm giám mục phó ngày 10-6-1975.
Từ năm 1975 cho đến khi qua đời (24-2-1989), Đức cha chỉ tập trung cho việc giảng dạy giáo lý và giáo dục cộng đồng dân Chúa.
Ngày 24-2-1989, Đức cha Anrê Nguyễn Văn Nam chính thức nhận chức giám mục chính toà Mỹ Tho và cai quản giáo phận cho đến khi nghỉ hưu vào năm 1999. Ngày 23-3-1993, cha Gioan Baotixita Phạm Minh Mẫn, Giám đốc Đại chủng viện Thánh Quý (Cần Thơ), được Toà Thánh bổ nhiệm làm giám mục phó giáo phận cho đến năm 1998 và được thuyên chuyển về Tổng giáo phận TP. Hồ Chí Minh (1-3-1998).
Ngày 26-3-1999, cha Phaolô Bùi Văn Đọc, Tổng đại diện giáo phận Đà Lạt, được Toà Thánh bổ nhiệm làm giám mục chính toà giáo phận Mỹ Tho và nhận giáo phận ngày 27-5-1999.