Từ khi dòng Phanxicô chịu trách nhiệm vùng Sài Gòn Hạ và các tỉnh miền Tây, công việc truyền giáo tại đây bắt đầu phát triển mạnh, đặc biệt cha F. José García coi sóc vùng Chợ Quán năm 1723.

Năm 1699, Đức cha F. Perez viết thư xin các cha dòng Phanxicô ở Manila đến giúp, công việc truyền giáo phát triển mạnh, nhất là khi Đức Khâm sai Toà Thánh phân chia lại các vùng truyền giáo. Cha José García coi sóc vùng Chợ Quán (1723), ngài đến tận Cái Hô, Cái Mơn, Cái Nhum. Ngày 2-7-1740, Đức cha Elzéar-François des Achards de la Baume, Khâm sai Toà Thánh, ra quyết định phân chia cho các cha dòng Phanxicô phục vụ từ Thủ Đức tới Hà Tiên với số giáo dân là 5.500. Năm 1749, cha Francisco Hermosa ở Thủ Ngữ. Ngày 12-7-1768, Thánh bộ Truyền giáo phân khu vực Cahon (Thủ Ngữ), Nan-khu, Tleng cho các thừa sai thuộc Thánh Bộ và Hội Thừa sai Paris coi sóc.

Ngày 16-6-1800, Đức cha Jean Labartette Gioang lập dòng Mến Thánh Giá tại Cái Nhum. Năm 1844, Đức cha Dominique Lefèbvre Ngãi lập dòng Mến Thánh Giá Cái Mơn. Các cha dòng Phanxicô cùng với nam nữ tu sĩ và giáo dân đã phát triển thêm nhiều giáo xứ, giáo họ cho đến năm 1813 và hầu hết các cha trở về Manila. Từ năm 1822, Vĩnh Long còn một số cha dòng Phanxicô ngành Capuxinô, đa số là người Ý, các thừa sai của Thánh Bộ hoạt động từ thời Đức cha Pigneau de Béhaine Bá Đa Lộc như cha Francisco Disan Michele ở Cái Nhum. Tháng 6-1821, cha Odorico Giomei di Collodi Phương cập bến Cửa Hàn, cha xuống vùng Chợ Quán học tiếng và phong tục với cha Giuseppe Maria, sau ít tháng, cha được cử đến miền Lục Tỉnh có trụ sở chính ở Cái Mơn, đến năm 1834, cha lãnh triều thiên tử đạo. Cái Nhum là trung tâm truyền giáo của các cha dòng Phanxicô trên một thế kỷ, cha Phương là vị cuối cùng của dòng phục vụ tại đây.

Năm 1850, Cái Nhum, Cái Mơn, Bãi Xan trở thành giáo xứ lớn, có linh mục phục vụ. Chính thời kỳ bách hại này, giáo phận và các giáo xứ vẫn phát triển mạnh. Các linh mục, nam nữ tu sĩ thường xuyên đến phục vụ tại các họ đạo và gia đình.

Trong thời các vua nhà Nguyễn cấm đạo (1833-1862), và nhóm sĩ phu tàn sát Công giáo (1867-1872), các thừa sai, linh mục, tu sĩ và giáo dân đã dùng mạng sống để minh chứng Tin Mừng Đức Kitô trước nhà cầm quyền, trong số này nổi bật là cha Thánh Philipphê Phan Văn Minh và Thánh Giuse Nguyễn Văn Lựu (trùm họ).

Ngày 8-1-1938, Toà Thánh ban sắc chỉ tách các tỉnh: Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre và phần đất nằm ở tả ngạn sông Hậu, tức tỉnh Sa Đéc sau này để lập thành giáo phận Vĩnh Long, và cử cha Phêrô Ngô Đình Thục (Huế) làm giám mục. Khi thành lập, giáo phận gồm 47 linh mục Việt, 3 thừa sai, 24 chủng sinh, 61 tiểu chủng sinh, 45.318 giáo hữu và 1.780 tân tòng. Giáo phận chia làm 7 hạt, 35 giáo xứ, 106 giáo họ.

Ngày 15-8-1944, khai giảng Tiểu chủng viện Á Thánh Minh với 170 chủng sinh. Tu hội Sư Huynh Kitô Vua ở Cái Nhum được thành lập với 38 sư huynh và 100 đệ tử; dòng Mến Thánh Giá Cái Nhum và Cái Mơn có trên 400 nữ tu.

Ngày 24-11-1960, giáo phận tông toà Vĩnh Long được nâng lên hàng giáo phận chính toà, Đức cha Ngô Đình Thục ra Huế làm Tổng giám mục, Đức cha Antôn Nguyễn Văn Thiện được chỉ định làm giám mục chính toà Vĩnh Long. Năm 1961, Đức cha Thiện lập Trung tâm Truyền giáo tại ngã ba đi Cần Thơ, năm 1964 trở thành đại chủng viện cho 3 giáo phận trong vùng và Trung tâm Truyền giáo dời về Cầu Vồng. Sau khi bị bệnh, ngài sang Pháp nghỉ hưu và Đức cha Giacôbê Nguyễn Văn Mầu trở thành giám mục chính toà Vĩnh Long từ năm 1968. Đức cha Giacôbê đã tích cực đào tạo hàng giáo sĩ, tu sĩ và hoạt động Công giáo tiến hành của giáo dân. Ngài đã thành lập nhiều giáo xứ mới và số giáo dân trong giáo phận tăng cao. Từ năm 1975, trong hoàn cảnh khó khăn, ngài đã âm thầm nâng đỡ tinh thần của đoàn dân Chúa.

Sau 65 năm thành lập (tính đến năm 2003), giáo phận chia làm 10 giáo hạt, 84 giáo xứ và 183.728 giáo dân, hàng giáo sĩ: 164 linh mục.

Ngày 3-7-2001, Toà Thánh chấp thuận cho Đức cha Giacôbê Nguyễn Văn Mầu nghỉ hưu (ngài mất ngày 31-1-2013) và trao quyền coi sóc giáo phận cho Đức cha Tôma Nguyễn Văn Tân.